Jose Antonio Galián Megías¹, VICTOR JIMENEZ COLL¹, MARIA FERNANDA SOTO RAMIREZ¹, Carlos Sánchez Rodríguez¹, María del Carmen Botella Martínez¹, ERICA MARIA Novoa Bolivar¹, HELIOS MARTÍNEZ BANACLOCHA¹, Manuel Muro Amador¹

(1) INMUNOLOGÍA E INMUNOTOLERANCIA EN TRASPLANTES Y ENFERMEDADES DE BASE INMUNOLÓGICA, IMIB-Arrixaca, España

El factor de complemento C4 está codificado en humanos por dos genes, C4A y C4B. Estos genes codifican dos isoformas con ciertas diferencias a nivel funcional. Las posiciones isotípicas se encuentran en los nucleótidos que codifican los aminoácidos 1101(P/L), 1102 (C/S), 1105 (L/I), 1106 (D/H) de la proteína C4 (C4A/C4B, respectivamente, Figura 1B). Los dos genes se encuentran dentro de la región del complejo mayor de histocompatibilidad de clase III, estrechamente relacionados con los genes STK19, CYP21 y TNXB, con los cuales forman una unidad multigénica: STK19-C4An-C4Bn-CYP21-TNXB (Figura 1A). En este complejo, los genes de C4 aparecen repetidos en número variable de copias (n=0-3), siendo lo más usual n=1 (STK19-C4A-C4B-CYP21-TNXB), lo que da por genoma diploide dos copias de C4A y otras dos de C4B, aunque en la población normal varía desde 0 copias hasta 4 o más copias de alguna de las isoformas. Está ampliamente descrita una alta asociación entre un bajo número de copias de los genes C4 y el riesgo de padecer determinadas enfermedades autoinmunes. La más referenciada es la asociación entre la ausencia o el bajo número de copias de C4A y el lupus eritematoso sistémico. Para el déficit de C4B, las consecuencias clínico-patológicas son menos claras. En este trabajo tratamos de diseñar una sencilla prueba de ADN, mediante PCR Real Time con sondas específicas que se posicionan justamente en los nucleótidos isotípicos, para evaluar la simple presencia o ausencia de cualquiera de las dos isoformas en la familia de una paciente de 6 años de edad con hipocomplementemia C4 mantenida y microhematuria desde los 3 años como único síntoma.

Se utilizaron dos sondas taqman que incluyeran las máximas posiciones isotípicas, utlizando los fluorocromos FAM y HEX asociados al quencher BHQ (Merk®). Los primers directo y reservo se diseñaron para una posición común a los dos genes y en la zona exónica. De tal forma, se diseñó una PCR Real Time en la que en un solo pocillo podíamos detectar la presencia de ambas isoformas. La extracción de ADN se hizo a partir de muestras de sangre periférica en un equipo Maxwell® CSC siguiendo las instrucciones del fabricante. La PCR Real Time se llevó a cabo en un termociclador de Applied Biosystems con el siguiente protocolo: 94ºC 4´, 25 ciclos de 94ºC 30´´- 60ºC 30´´- 72ºC 1´, y 72º 4´. Las concentraciones de los reactivos son iguales a los descritos en cualquier técnica de PCR Real Time común en los laboratorios (más info en contacto). Los amplificados de la PCR Real Time fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% teñido con Redsafe. Posteriormente los resultados fueron validados mediante secuenciación de sanger en un equipo ABI3500 de Applied Biosystems, utilizando los primers de la PCR.

Las muestras pertenecían a padre, madre, hermano pequeño (hijo) y la propia paciente (hija). El resultado de la PCR muestra que el padre y los dos hijos solo dieron señal para la sonda FAM-C4A, y la madre para las dos sondas, FAM-C4A y HEX-C4B. Los resultados se reprodujeron en la secuenciación de los amplificados.

La técnica funciona y parece robusta (comprobada en estudios familiares posteriores, no mostrados). Los resultados sugieren que el padre no presenta ningún haplotipo que codifique para C4B y que la madre es portadora de un haplotipo que codifica para C4B y otro que no. Este último haplotipo es el que fue heredado por ambos hijos, dando como resultado una constitución genética incapaz de producir C4B.