SONIA ÁGUILA MARTÍNEZ¹, Juan Carlos García Cañaveras², MARIA PIEDAD FERNÁNDEZ PÉREZ¹, Laura Zapata Martínez³, NURIA GARCÍA BARBERÁ¹, ASCENSION MARIA DE LOS REYES-GARCIA PASTOR¹, laura reguilón gallego¹, Vicente Vicente García¹, Agustín Lahoz², Rocío González-Conejero Hilla¹, CONSTANTINO MARTÍNEZ GÓMEZ¹

(1) HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL, IMIB-Arrixaca, España
(2) Unidad de Biomarcadores y Medicina de Precisión (UBYMP). IIS La Fe (Valencia), España (Comunidad Valenciana)
(3) Centro Regional de Hemodonación, 30540, España (Región de Murcia)

Los neutrófilos constituyen la primera línea de defensa del organismo frente a la invasión de patógenos. Así, su respuesta ante distintos estímulos inflamatorios da lugar a la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET) para eliminar estos patógenos, e implicándolos a su vez, en inmunotrombosis. Nuestro grupo ha demostrado en un modelo in vitro e in vivo que la deficiencia de miR-146a, un regulador negativo de inflamación, tiene un papel en la NETosis y además en trombosis, aunque el mecanismo molecular subyacente es desconocido. Dado que la NETosis supone un elevado gasto energético, nuestra hipótesis es que la deficiencia de miR-146a condiciona alteraciones del metabolismo celular que favorecen una mayor formación de NET. Por lo tanto, nuestro objetivo en este estudio fue explorar en neutrófilos deficientes en miR-146a, el metabolismo y la producción de ROS, fenómenos cruciales para su funcionalidad y la formación de NET.

Purificamos neutrófilos de médula ósea de ratones WT y miR-146a-/-. Se analizó la explosión respiratoria (OCR) y la glicólisis global (tasa de acidificación extracelular, ECAR) por Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent), así como la producción de ROS globales y mitocondriales por citometría de flujo. Cuantificamos expresión de NADPH oxidasa (Nox2) y otras enzimas metabólicas importantes por RT-qPCR. Realizamos un estudio metabolómico profundo, no dirigido con espectrómetro de masas de alta resolución (quadrupole-orbitrap mass spectrometer, Q Exactive) junto con cromatografía de ultra alta resolución (Vanquish). Por último, se hizo un modelo de trombosis arterial con FeCl3 analizando el contenido de NET (citH3) en el trombo mediante fluorescencia.

Tras la estimulación con PMA los neutrófilos deficientes en miR-146a presentaron una mayor explosión respiratoria, comparados con neutrófilos WT. Además estos neutrófilos mostraron una mayor generación de ROS, aunque esta producción diferencial no procedía de la mitocondria, si no de la NADPH oxidasa. Sin embargo, no se detectaron diferencias en la expresión de Nox2. Mediante el uso del Seahorse se observó que neutrófilos de ratones miR-146a-/- presentaron una mayor glicólisis que neutrófilos WT, mediada indirectamente como la tasa de acidificación extracelular (ECAR). En el estudio metabolómico se observó un incremento del piruvato y el lactato (productos de la glicólisis) en neutrófilos miR-146a-/-. Además los niveles de los intermediarios de la ruta de las pentosas fosfato (PPP), como el NADPH, fueron más altos en neutrófilos miR-146a-/-. Por lo tanto, la alta producción de ROS por parte de la NADPH oxidasa fue sustentada por la elevada generación de NADPH en la PPP. Sin embargo, no se observaron diferencias en la expresión en una de las enzima clave en esta ruta, la glucosa 6-P deshidrogenasa. Por último, en el modelo de trombosis arterial in vivo se observó mayor cantidad de citH3 en los trombos de ratones miR-146a-/- vs WT.

La deficiencia de miR-146a en neutrófilos provoca una reprogramación metabólica, aumentando el flujo glicolítico y la activación de la PPP, promoviendo así una mayor generación de ROS, procesos todos ellos clave para la formación de NET. En consonancia, los trombos arteriales inducidos mostraron una mayor NETosis en los ratones deficientes en este miRNA. Por tanto, estos cambios metabólicos fundamentales en el neutrófilo podrían ser clave en la inmunotrombosis mediada por la deficiencia o la reducción en los niveles del miR-146a.