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DIAGNÓSTICO MOLECULAR EMPLEANDO SECUENCIACIÓN DE TERCERA GENERACIÓN: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE NUEVOS MECANISMOS MOLECULARES IMPLICADOS EN DEFICIENCIA DE ANTITROMBINA.

Autores:

Belén de la Morena Barrio1, Eugenia de la Morena Barrio1, Alba Sanchis-Juan2, José Padilla Ruiz1, ANTONIA MIÑANO NAVARRO1, Carlos Bravo Perez1, ROSA CIFUENTES RIQUELME1, Willem Ouwehand2, Vicente Vicente García1, Javier Corral de la Calle1

Afiliaciones:

(1) HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL, IMIB-Arrixaca, España
(2) Department of Haematology, University of Cambridge, NIHR BioResource, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, Cambridge Biomedical Campus, NHS Blood and Transplant Centre, Cambridge, UK, Reino Unido

Comunicación:

Antecedentes:

Los sistemas de secuenciación masiva han revolucionado el diagnóstico molecular. Sin embargo, existen todavía limitaciones, como la identificación y caracterización de variaciones estructurales (VE) o la definición de haplotipos. Los sistemas de secuenciación de 3ª generación, basados en secuencias largas (hasta 2.5 Mb), son idóneos para resolver estos problemas. En este estudio hemos aplicado secuenciación por nanoporos al diagnóstico molecular de deficiencia de antitrombina, la trombofilia más grave.

Métodos:

Se secuenció el genoma completo por nanoporos (PromethION) en 19 pacientes no relacionados con deficiencia de antitrombina seleccionados de nuestra cohorte de 250 pacientes. 8 presentaban una VE en SERPINC1 detectada por MLPA. 11 casos no tenían base molecular identificada por Sanger, MLPA, secuenciación completa del gen por NGS (PGM e Illumina) y análisis de glicosilación. El mismo método, esta vez con la plataforma MinION, se usó para secuenciar dos PCRs largas (6.6 y 8,8 Kb) que cubren SERPINC1 en 10 pacientes africanos con deficiencia de antitrombina causada por la variante p.Thr147Ala.

Resultados:

La secuenciación por nanoporos detectó todas las VE, independientemente de su tamaño o tipo (Fig1). Además ha permitido identificar la primera VE compleja implicada en esta patología (Fig2). La resolución nucleotídica permitió caracterizar el punto de ruptura de las VEs, demostrando la implicación de elementos repetitivos y la microhomologías, lo que sugiere un mecanismo de formación tipo BIR/MMBIR/FoSTes. Además, identificamos la base molecular de la deficiencia en dos casos: una inserción de 2440pb en el intrón 6 de SERPINC1 (Fig1). El ensamblaje de novo permitió conocer que se trataba de un nuevo retrotransposon SVA cercano al tipo SVA-E en el árbol filogenético, que presentaba inserción antisentido, y estaba flanqueado por una tándem site duplication (TSD) de 14pb (Fig1). La validación de la inserción en los pacientes y familiares afectos se consiguió mediante una PCR específica. Este método permitió identificar un nuevo caso sin base molecular conocida que presentaba el mismo SVA. Los tres casos, con deficiencia tipo I y trombosis, compartían las mismas características (SVA, posición y TSD). Estos datos, junto a que también comparten un polimorfismo intragénico de muy baja frecuencia y a su transmisión germinal, sugieren un efecto fundador. Finalmente, la secuenciación por nanopororos de SERPINC1 en dos PCR largas reveló un haplotipo común compuesto por 13 marcadores intragénicos asociado a la mutación p.Thr147Ala en los 10 pacientes africanos portadores.

Conclusiones:

Mostramos nuevas evidencias de la fortaleza de la secuenciación por nanoporos para la identificación y caracterización de VE, y que ayuda a conocer el mecanismo implicado en su formación. Además, hemos caracterizado la primera inserción de un retrotransposón implicada en deficiencia de antitrombina, aumentando el espectro de enfermedades asociadas a retrotrasposones. Esta VE, por implicar un elemento rico en regiones repetitivas que se inserta en una región intrónica, es de difícil diagnóstico molecular. Se trata de una VE recurrente, 1% de nuestra cohorte, con un efecto fundador. Finalmente, demostramos la idoneidad de la secuenciación con nanoporos para la determinación de haplotipos en secuencias largas, lo que han permitido identificar la primera mutación fundadora con origen africano responsable de deficiencia de antitrombina.


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