Salvador Carrillo Tornel¹, ANA MARIA HURTADO LOPEZ², TZU-HUA CHEN LIANG², Anna Puiggros³, Andrea Gómez³, María Dolores García Malo⁴, Francisco José Ortuño Giner², Vicente Vicente García², Blanca Espinet³, Andres Jerez Cayuela²

(1) Estudiante predoctoral - Centro Regional de Hemodonación - H.G.U. Morales Meseguer, 30003, España (Región de Murcia)
(2) HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL, IMIB-Arrixaca, España
(3) Laboratori de Citogenètica Molecular, Servei de Patologia. Grup de Recerca Translacional en Neoplàsies Hematològiques, Institut Hospital del Mar d'Investigacions Mèdiques (IMIM), Barcelona, España (Cataluña)
(4) Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales Meseguer. CRH-IMIB. Universidad de Murcia, 30003, España (Región de Murcia)

La leucemia linfática crónica (LLC) es una neoplasia incurable con considerable heterogeneidad clínica. Esto plantea un gran desafío para el desarrollo de un tratamiento efectivo, ya que las respuestas a nuevas terapias pueden variar según el subtipo biológico de la enfermedad. NOTCH1 se ha mostrado como el gen mutado más comúnmente en la LLC al momento del diagnóstico, su frecuencia aumenta con la progresión y se ha relacionado con una mayor tasa de progresión a linfoma de alto grado. Nuestro objetivo fue buscar diferencias en la clínica, en la presencia de mutaciones y alteraciones cromosómicas, inmunofenotipo y en la expresión de genes que rigen la entrada del ciclo celular en un subgrupo mutado para NOTCH1 dentro de una cohorte de pacientes con LLC.

Realizamos secuenciación de nueva generación en 378 casos. De ellos, 235 pacientes disponían de una caracterización por citometría de flujo con un panel fijo de 14 monoclonales. Finalmente, en 95 pacientes, incluyendo 27 casos con mutación en NOTCH1, disponíamos de ARN de la fracción CD19+ que usamos para la determinación de la expresión por RT-qPCR de 11 genes determinantes de las fases G0-G1 del ciclo celular. Además, utilizamos células CD19+ de 7 pacientes NOTCH1 wild type y 2 NOTCH1 mutados para ensayos de estimulación de entrada en ciclo celular y silenciamiento mediante siRNAs y electroporación de genes diana.

La cohorte global (n=378) presentaba un edad media de 67 años, con predominio del género masculino (63%). Un 15% de los pacientes presentaban al diagnóstico un estadio Rai≥2 (Tabla 1). NOTCH1 se encontró mutado en el 9.8% de los casos en nuestra cohorte, siendo la variable canónica P2514fs*4 (delCT) la más frecuente, en el 78% de los pacientes. Encontramos, de manera significativa, una mayor concentración linfocitaria, una mayor asociación con la trisomía 12, junto con una menor frecuencia de la del(13q) en aquellos pacientes con NOTCH1 mutado. A través de un estudio citométrico completo, determinamos que una baja expresión del marcador CD25, subunidad alfa del receptor de IL-2, fue una característica clave en el subgrupo de pacientes con mutaciones en NOTCH1; junto con una mayor expresión de la cadena monoclonal. Sin embargo, no encontramos una menor expresión de CD20 en los pacientes mutados para NOTCH1, dato que algunos autores asocian a una peor respuesta a las combinaciones con anti-CD20 (Tabla 2). Finalmente, el ensayo de expresión génica del ciclo celular en la LLC reveló una sobreexpresión de los efectores de la fase G0-G1 temprana (CDK4, CDK6, CCND1, CCND2, CCND3) y una represión del inhibidor p27 en estado basal. El ensayo competitivo de estimulación celular in vitro mostró un patrón de expresión diferencial respecto al estado basal, aumentando la expresión de los electores de la fase G1 tardía (CDK2, CCNE1, CCNE2) (Figura 1).

Describimos, por vez primera, una relación entre una menor expresión del marcador CD25 y mutaciones en NOTCH1 en el contexto de la LLC, lo que podría ser indicativo de la hiporreactividad linfocitaria en este subgrupo de pacientes. También definimos un patrón “especular” de expresión de los moduladores del ciclo celular en células LLC, en función del estado basal o estimulado. Estas características específicas podrían explicar, en parte, las peculiaridades clínicas propias de los pacientes con mutaciones en NOTCH1 y ayudar a definir estrategias terapéuticas ad hoc.