Comunicación

INHIBICIÓN DE CDK4/6 EN PACIENTES CON LEUCEMIA LINFÁTICA CRÓNICA Y MUTACIONES EN NOTCH1: BASES PRECLÍNICAS PARA UNA POTENCIAL TERAPIA DIRIGIDA

Autores:

SALVADOR CARRILLO TORNEL1, Ana María Hurtado López1, TZU-HUA CHEN LIANG1, Anna Puiggros2, Andrea Gómez Llonín3, Mª Dolores García Malo1, Ernesto José Cuenca Zamora1, Francisco José Ortuño Giner1, Vicente Vicente García1, Blanca Espinet2, Andres Jerez Cayuela1

Afiliaciones:

(1) HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL, IMIB-Arrixaca, España
(2) Laboratori de Citogenètica Molecular, Servei de Patologia. Grup de Recerca Translacional en Neoplàsies Hematològiques, Institut Hospital del Mar d'Investigacions Mèdiques (IMIM), Barcelona, Spain., España (Cataluña)
(3) aboratori de Citogenètica Molecular, Servei de Patologia. Grup de Recerca Translacional en Neoplàsies Hematològiques, Institut Hospital del Mar d'Investigacions Mèdiques (IMIM), Barcelona, Spain., España (Cataluña)

Comunicación:

Antecedentes:

Las respuestas a estrategias terapéuticas en la leucemia linfática crónica (LLC) varían según el subtipo biológico. Los pacientes con mutaciones en NOTCH1 (NOTCH1MUT) muestran respuestas insatisfactorias a la quimioinmunoterapia. NOTCH1 es el gen mutado con mayor frecuencia en la LLC al diagnóstico, su frecuencia aumenta con la progresión y se ha relacionado con una mayor tasa de transformación a linfoma de alto grado. El objetivo de este trabajo consistió en una caracterización integral del ciclo celular en estos pacientes, lo que nos impulsó a explorar in vitro el uso de moléculas dirigidas frente a las características únicas encontradas.

Métodos:

Secuenciación de nueva generación en 378 casos al diagnóstico de LLC. En 95 pacientes, 27 NOTCH1MUT, determinamos la expresión por RT-qPCR de la fracción CD19+ de 11 genes del ciclo celular. Cultivamos células primarias de LLC, con y sin mutaciones adquiridas para NOTCH1, con IL-4 y CD40L para someterlas posteriormente a ensayos de ciclo celular, viabilidad y silenciamiento. Ensayos que fueron incorporados al experimento farmacológico empleando un inhibidor de CDK4/6 (Palbociclib).

Resultados:

Reclutamos 378 casos diagnosticados de LLC, con una media de 67 años y predominio masculino (63%). NOTCH1 se encontró mutado en el 9.8% de los casos, siendo la variante canónica P2514fs*4 (delCT) la más frecuente, en el 78% de los pacientes. Encontramos, de manera significativa, una mayor concentración linfocitaria y una mayor asociación con la trisomía 12 en aquellos pacientes con NOTCH1MUT. El ensayo de expresión génica del ciclo celular en la LLC reveló una sobreexpresión de los efectores de la fase G0-G1 temprana (CDK4, CDK6, CCND1, CCND2, CCND3) y una represión del inhibidor p27 en estado basal. El ensayo competitivo de estimulación celular in vitro mostró un patrón de expresión diferencial respecto al estado basal, aumentando la expresión de los efectores de la fase G1 tardía (CDK2, CCNE1, CCNE2). Los ensayos de silenciamiento con siRNA NOTCH1 eliminaron las diferencias de expresión de estos genes en los casos NOTCH1MUT. El análisis por citometría de flujo de las fases del ciclo celular en 5 pacientes con mutaciones clonales para NOTCH1 y 6 casos wild type, mostró en los casos mutados una mayor proporción de células, en fases distintas a la G0-G1, de manera estadísticamente significativa (p<0.004) (Figura 1). Se analizo la viabilidad resultante del uso de 8 concentraciones distintas de Palbociclib en 2 casos NOTCH1MUT. Para los ensayos siguientes, elegimos las dos concentraciones más bajas con las que observamos una reducción en la viabilidad celular, teniendo en cuenta el tiempo de exposición al fármaco (5 días) y su farmacodinámica (concentración máxima en plasma) testada en diferentes líneas celulares. En el ensayo farmacológico in vitro usando Palbociclib a dosis de 1 y 10 μM, se obtuvieron reducciones de manera dosis-dependiente del porcentaje celular en fase S (18% vs. 0.64% y 0.05%; p=0.0002 respectivamente), así como un incremento marcado en el porcentaje de células no viables tras tratamiento en los pacientes NOTCH1MUT, sin alcanzar la significación estadística (Figura 2).

Conclusiones:

Las características del ciclo celular propias de los pacientes con LLC y mutaciones en NOTCH1 se muestran, in vitro, como potenciales dianas terapéuticas, donde la inhibición de CDK4/6 se tradujo en una mayor eficacia. Estos resultados proporcionan una base racional preclínica para explorar estrategias con el objetivo de incrementar las respuestas terapéuticas en los pacientes con LLC y mutaciones de NOTCH1.


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