Comunicación

ANÁLISIS MEDIANTE SECUENCIACIÓN MASIVA PROFUNDA DE MOSAICISMO Y PERFILES INTRÓNICOS COMO BASE DE DEFICIENCIA DE ANTITROMBINA DE CAUSA DESCONOCIDA

Autores:

Pedro Garrido Rodríguez1, Belén de la Morena Barrio2, ROSA CIFUENTES RIQUELME2, José Padilla Ruiz2, Carlos BRAVO PEREZ2, ANTONIA MIÑANO NAVARRO2, Vicente Vicente García2, Eugenia de la Morena Barrio2, Javier CORRAL DE LA CALLE2

Afiliaciones:

(1) Servicio de Hematología y Oncología Médica, Hospital Universitario Morales Meseguer, Centro Regional de Hemodonación, Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca, CIBERER, Murcia, Spain., 30003, España (Región de Murcia)
(2) HEMATOLOGÍA Y ONCOLOGÍA MÉDICA CLÍNICO-EXPERIMENTAL, IMIB-Arrixaca, España

Comunicación:

Antecedentes:

Un porcentaje de casos con enfermedades genéticas no tienen una base molecular conocida utilizando las técnicas de rutina. En el caso de la deficiencia de antitrombina, estos pueden llegar al 20%. La búsqueda de la base molecular en estos casos debe abordarse explorando nuevos mecanismos o empleando nueva metodología. El objetivo fue la evaluación del mosaicismo y perfiles genéticos intrónicos como posibles bases moleculares de deficiencia de antitrombina.

Métodos:

Secuenciación masiva profunda con lecturas cortas (2508x) y largas (130x) del gen SERPINC1 en 26 casos con deficiencia de antitrombina, seleccionados de una cohorte de 403 casos no relacionados, por carecer de alteraciones detectadas por métodos de rutina (secuenciación Sanger de exones y MLPA) . El estudio molecular se realizó con ADN de células de sangre periférica. La detección de mosaicos y perfiles genéticos intrónicos se hizo con un protocolo bioinformático propio. Empleamos herramientas de predicción de patogenicidad (HSF, regSNPintron, MutationTaster, PolyPhen2). El genotipado de variantes de interés en 305 controles sanos se realizó con sondas taqman.

Resultados:

La mayoría de los casos (86%) presentaron deficiencia moderada (actividad AntiFXa 70-80%). Para la búsqueda de mosaicismo, se buscaron variantes genéticas en regiones codificantes y zonas flanqueantes (+/-20pb) presentes en al menos el 5% de las lecturas. Identificamos una media de 9 variantes/paciente. Descartamos las indel por considerarse artefactos (Song et al. Sci Rep 2017). Dos variantes eran polimorfismos germinales silenciosos (c.981A>G y c.1011A>G). Otras dos SNVs, uno missense (c.100G>C, p.Gly34Arg) y un intrónico (c.409-12T>G), ambos de baja frecuencia (MAF< 0.0001), se descartaron como potenciales mosaicos por su baja representación (<15% de lecturas), la detección en 10 o más casos de nuestro estudio y por estar ubicados en regiones homopoliméricas. Por otra parte, la búsqueda de perfiles intrónicos germinales identificó 2 destacados, cada uno con dos SNPs ligados (r2>0.91) que afectaban al mismo alelo, como demostró la secuenciación por nanoporos. Estos perfiles (Tabla 1) presentaron 4 veces mayor prevalencia encontrada de la esperada según la MAF (p=0.018) y en todos, menos en un caso, la deficiencia identificada fue moderada: 1. c.41+141G>A se asoció a niveles menores de antitrombina en controles (Anti-FXa:95%; p=0.037). El intrón 1 contiene elementos reguladores que podrían estar afectados por estas variantes. Además, c.41+645G>A podría generar una secuencia donadora críptica según HSF. 2. Un paciente con este perfil, que además presentaba en el otro alelo una mutación en el intrón 4 (c.762+329G>T) tenía una deficiencia más acusada.

Conclusiones:

Nuestro estudio descarta que el mosaicismo sea el origen de la deficiencia de antitrombina en casos sin base molecular conocida. Sin embargo, identificamos dos perfiles de alteraciones intrónicas que parecen ser responsables de una reducción moderada de los niveles de antitrombina. Financiación: ISCIII&FEDER-PI18/00598;FundaciónSéneca-19873/GERM/15;ISCIII- CM20/00094;FI19/00048.


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