Marta Ascensión García Villar¹, Paula Cots Rodríguez², Miriam Balastegui Alarcón², Leopoldo Gonzalez Brusi², Pilar Soria Monzó², JOSE BALLESTA GERMAN², MARIA JOSE IZQUIERDO RICO², MANUEL AVILES SANCHEZ²

(1) Universidad de Murcia, 30204, España (Región de Murcia)
(2) INTEGRACIÓN MORFOFUNCIONAL DE CÉLULAS Y TEJIDOS, IMIB-Arrixaca, España

La fecundación y las primeras etapas del desarrollo embrionario se producen en la trompa de Falopio (oviducto). El fluido oviductal tiene una composición compleja siendo la proteína OVGP1, también conocida como oviductina, la proteína secretada mas abundante en este órgano. Sin embargo, se ha visto que el gen que codifica esta proteína está pseudogenizado en la rata (Rattus norvegicus). El objetivo de este estudio es identificar la expresión y presencia de otras proteínas de la familia a la que pertenece OVGP1 que pudieran desempeñar un papel funcional similar.

Todos los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Murcia. Se realizó un análisis de la expresión génica de oviducto de rata. Para ello, se obtuvo ARN de muestras oviductales de rata (n=3) siguiendo las indicaciones del kit comercial RNAqueousTM (Invitrogen®). Posteriormente, tomando como molde el ARN obtenido, se obtuvo el ADN complementario (ADNc) utilizando el kit comercial QuantiTect® Reverse Transcription kit (QIAGEN®). Se diseñaron cebadores, en base a la secuencia de ARN mensajero (ARNm) de CHIA en rata de la base de datos Ensembl (ENSRNOG00000033162), mediante el uso la herramienta Primer Designing Tool BLAST® y estos fueron suministrados por la casa comercial Sigma Aldrich®. El ADNc obtenido fue utilizado para realizar amplificaciones por PCR, donde se pretendía detectar la expresión de CHIA. Los amplicones se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa, cuyo producto fue purificado y enviado al servicio de secuenciación (ACTI, Universidad de Murcia). La secuencia obtenida se comparó con la secuencia teórica de ADNc de CHIA en la base de datos Ensembl (ENSRNOG00000033162). Se realizó un estudio proteómico del fluido oviductal mediante HPLC –MS/MS. Se realizó igualmente un análisis por Western blot empleando anticuerpo policlonal anti-CHIA de rata producido en conejo 1:1000 (Proteintech®, Thermo Fisher Scientific®) y un anticuerpo monoclonal anti –IgG de conejo – HRP producido en ratón 1:10000 (Santa Cruz Biotechnology®), utilizado como anticuerpo secundario. Por último, se realizó una localización de la proteína mediante técnicas inmunohistoquímicas, empleando un anticuerpo policlonal anti – CHIA de rata producido en conejo 1:100 (Proteintech®, Thermo Fisher Scientific®) y un anticuerpo anti – IgG de conejo – HRP producido en ratón 1:10000 (Santa Cruz Biotechnology®), que fue utilizado como anticuerpo secundario.

Los estudios de expresión génica revelaron la existencia de ARNm codificante para la quitinasa ácida de mamíferos (AMCase) en oviducto de rata. Se observó una moderada señal inmunohistoquímica a nivel del epitelio oviductal. Además, se demostró la presencia de AMCase en oviducto, mediante HPLC – MS/MS, a partir de la existencia de péptidos coincidentes con la enzima estudiada, en bandas de 75 kDa y de más de 300 kDa. La técnica de Western blot reveló coincidencias con la enzima AMCase, exclusivamente, en bandas de peso molecular de 75 kDa. Son necesarios estudios posteriores para esclarecer los diferentes resultados obtenidos con las técnicas de proteómica y Western blot.

Este estudio demuestra la expresión del gen CHIA y de la proteína AMCase en el oviducto de la rata. Esta proteína, al ser de la misma familia que OVGP1, podría realizar funciones similares. Son necesarios posteriores estudios para determinar su funcionalidad e implicación en el proceso reproductivo.