Rubén Cárdenas Gámez¹, Verónica Castillo Guardiola², Begoña Alburquerque González³, Fernando Feliciano López Calderón⁴, Daniel Torres Moreno⁵, Carlos Rodríguez Rojas⁶, Verónica Ramos Arenas⁷, María Dolores López Abellán⁷, Ángela Puche Candel⁷, Samir Attaibi⁷, RUBEN CORRAL SAN MIGUEL⁸, Pablo Conesa⁹

(1) Hospital General Universitario Santa Lucía, 30202, España (Región de Murcia)
(2) Facultativa especialista de análisis clínicos, 30202, España (Región de Murcia)
(3) Universidad Católica San Antonio de Murcia (UCAM). Grupo IMIB: Patología Molecular y Farmacogenética, 30003, España (Región de Murcia)
(4) Universidad Católica San Antonio de Murcia (UCAM). Grupo IMIB: Patología Molecular y Famracogenética., España (Región de Murcia), 30204, España (Región de Murcia)
(5) Grupo de patología molecular y farmacogenética IMIB. Hospital General Santa Lucía (Cartagena, Región de Murcia), 30202, España (Región de Murcia)
(6) Facultativo adjunto de análisis clínicos, 46014, España (Comunidad Valenciana)
(7) Residente Hospital General Universitario Santa Lucía, 30202, España (Región de Murcia)
(8) FISIOLOGÍA MÉDICA, IMIB-Arrixaca, España
(9) PATOLOGÍA MOLECULAR Y FARMACOGENÉTICA, IMIB-Arrixaca, España

La infección por el nuevo coronavirus SARS-CoV-2 ha supuesto un gran impacto en la población en comparación con otras especies de coronavirus previos. Los estudios sobre los mecanismos de entrada del virus SARS-CoV-2 y de sus diferencias con respecto a los empleados por el SARS-CoV pretenden explicar el distinto comportamiento de ambos virus en cuanto a infectividad, virulencia e inmunogenicidad. Los estudios muestran que el dominio de unión al receptor (RBD) de SARS-CoV-2 presenta una mayor afinidad por el receptor humano ACE2 que el SARS-CoV. Sin embargo, este RBD es menos accesible en el SARS-CoV-2, lo que podría contribuir a su menor inmunogenicidad. Por otro lado, los estudios de secuencia del SARS-CoV-2 muestran que éste presenta 12 pares de bases adicionales (CCU CGG CGG GCA) que permiten que, a nivel proteico, se codifique un motivo proprotein convertasa (PPC), del cual carecía el SARS-CoV. Este motivo es un punto de corte que, al ser reconocido por furina, preactiva la espícula del SARS-CoV-2, facilitando la entrada a las células diana y favoreciendo la infectividad. Este estudio pretende analizar el dominio RBD y la secuencia de 12 pares de bases adicionales del sitio PPC en muestras de casos importados de coronavirus de otras áreas geográficas y compararlas con la secuencia de origen.

Se utilizaron 6 muestras de exudado nasofaríngeo obtenidas en puntos COVID. La extracción de RNA a partir de las muestras previamente inactivadas se realizó en el equipo QIAcube (QIAGEN) empleando el Qiaamp Viral Kit. Posteriormente fueron analizadas mediante RT-PCR en el equipo ThermoFisher 7500 (Applied Biosystems). Se obtuvo resultado positivo en 4 muestras y negativo en 2. Tras su análisis, las muestras de RNA fueron conservadas a -80ºC. Estas muestras se utilizaron como controles positivos y negativos. Para realizar la secuenciación del fragmento a estudio, se realizó una retrotranscripción para obtener cDNA a partir de RNA con el kit Máxima First Strand sin dsDNAsa. A continuación se realizó la amplificación mediante PCR (PCRBiosystems) utilizando cebadores específicos diseñados empleando el software Primer3 (Figura 1). Para comprobar si el producto se había amplificado correctamente, éste fue analizado mediante electroforesis capilar en el equipo QIAxcel con el cartucho de análisis de fragmentos de DNA de alta resolución (ambos QIAGEN). Por último, los fragmentos correctamente amplificados se enviaron a secuenciar.

El ensayo se realizó con la combinación de primers previamente descrita. El resultado de la electroforesis fue satisfactorio para los fragmentos pequeños de tres muestras positivas. Posteriormente se envió a secuenciar los productos de la PCR obtenidos a partir de los primers forward 2-reverse 1, que abarcaban la secuencia a estudio (figura 2). En la imagen se puede observar que la secuencia relevante aparece con mucho ruido, posiblemente porque el primer reverse 1 está demasiado cerca.

En este ensayo hemos puesto a punto una técnica para secuenciar una parte del genoma del SARS-CoV-2. Tras los resultados obtenidos, se puede optimizar el método sintetizando nuevos primers que se adapten mejor a la región de estudio o usando otras técnicas, como la PCR anidada. Este método debe ser probado en casos COVID-19 positivos de individuos de diferentes zonas geográficas. El estudio resulta interesante ya que se puede observar si factores como la barrera geográfica pueden influir en la infectividad e inmunogenicidad del virus.